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單細胞測序前的3大關鍵問題,您都處理對了嗎?

提供者:上海遠慕生物科技有限公司   發布時間:2020/1/2  閱讀次數:252次   進入該公司展臺

在無數實戰經驗中,制備高質量的單細胞懸液被公認為重中之重。實驗過程中,如單細胞活性不高,細胞數過低,以及污染和雜質等問題,都會影響到有效單細胞數的產出、單細胞核酸的質量等,最終得到的單細胞數據分析及統計結果不可信。

那么,組織如何解離?需要選什么酶?還需要注意什么?遠慕生物根據相關權威文獻整理了單細胞懸液制備的方法和小貼士,讓我們一起來解決單細胞研究方案中的攔路虎。

實體組織解離關鍵——酶的合理選擇

實體組織解離兩大步驟,包含機械分離和酶消化處理。

首先,組織需要通過物理切割或刀片切碎,然后通過酶消化來分離細胞。特定的組織消化酶及消化時間不同,相關建議可參考如下表格:人和小鼠的部分組織類型——肝臟、肺、皮膚、脾臟、消化道、胰腺、腎臟、視網膜等。

表1 人鼠各類型組織酶解單細胞懸液方法總結[1]

除此之外,常用酶的類型還包括:Accutase™、彈性蛋白酶和膠原酶,以及商業酶混合物,如 TrypLE Express 和 Liberase Blendzyme 等。

血液處理成關鍵——離心穩定操作[1]

樣品經過密度離心(例如使用Ficoll-Paque或Histopaque-1077技術),可以直接用于外周血單核細胞(PBMC)捕獲[1]。

建議不少于5mL EDTA 抗凝血,且不要使用肝素抗凝管收集血液;同時注意在合適轉數離心操作后,管中內容物分為三層,上層為血漿(內含細胞碎片),中間層為分層液,底層為紅細胞,在上、中層液體界面處可見到乳白色混濁的單核細胞層( 白膜層,?。?。此時,需使用無菌吸管小心沿離心管壁周緣吸取界面層單核細胞后,再加入HBSS /PBS重懸。更多注意事項請參見華大科技單細胞送樣建議。

單細胞懸液制備的8條建議[1]

1. 建議采用無菌樣品處理方式,包括使用不含核酸酶的試劑和耗材。

2. 為降低對細胞的損傷,移液和離心應保持在最低程度。在一定的離心速度、時間和溫度下,細胞濃度和大小直接影響制備的效率。

3. 在進行細胞清洗和重懸過程中,使用具有合適大小的器皿,避免高濃度導致細胞集聚和結塊,請注意選擇。

4. 應使用適當大小的細胞過濾器過濾懸浮液,孔徑大于細胞直徑,以去除團塊和碎片。

5. 細胞清洗和復蘇,推薦使用含牛血清的磷酸鹽緩沖鹽水(不含鈣和鎂),減少細胞損失和聚集的白蛋白。

6. 細胞裂解升高可導致細胞團塊形成,在細胞分離過程中,DNase I可減少細胞團塊形成。

7. 細胞團塊會導致自動細胞計數器低估單個細胞的有效濃度,因此制備后應盡快處理懸浮液,最好在30分鐘內處理。

8. 總之,在單細胞制備中,盡可能減少細胞聚集物、死亡細胞、非細胞核酸和逆轉錄(RT)抑制劑是非常重要的。為了在最大限度地提高不同細胞類型的純度和無偏回收率的同時,最小化這些污染物,可能需要應用優化,例如,調整洗滌步驟的數量、洗滌溶液的組成、離心條件和/或過濾器類型。

 

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